Le 7 septembre 1565, une flotte espagnole venue de Sicile aborde sur l'île de Malte et vient secourir les habitants, soumis à un siège de la part des Turcs depuis le 18 mai précédent.

Découragés, les assiégeants rembarquent le 13 septembre 1565.

L'épisode reste connu sous le nom de Grand Siège. Il impressionne beaucoup les contemporains, qui tenaient pour invincible le sultan Soliman le Magnifique, lequel avait plus que doublé la superficie de son empire.

L'île est alors gouvernée par un ordre monastique, les chevaliers de Saint-Jean de Jérusalem, sous la direction du Grand-Maître Jean Parisot de la Valette (70 ans). Les Turcs, au nombre de 30.000, débarquent sur l'île et tentent d'investir les forts qu'occupent les chevaliers.

Le fort le plus avancé, Saint-Elme, tombe au bout d'un mois et tous ses défenseurs succombent.

Les Turcs clouent leurs cadavres sur des croix qu'ils envoient dans la passe de Malte pour saper le moral des autres défenseurs. À quoi La Valette réplique en faisant bombarder le camp turc avec des têtes de prisonniers...

Finalement, les assiégeants, peu désireux de passer l'hiver dans l'île, se résignent à regagner Istamboul. Le Grand-Maître ne se laisse pas étourdir par son succès. Il renforce les fortifications de l'île et fonde une nouvelle capitale qui, depuis sa mort, porte son nom, La Valette.

N'ayant garde d'oublier leur vocation d'origine, les chevaliers de Saint-Jean mettent sur pied une « infirmerie de Saint-Georges », qui va constituer pendant deux siècles un modèle d'hygiène et d'éthique médicale et chirurgicale. On y accueille blessés et malades sans discrimination de sexe, d'âge ni de confession, et bien sûr gratis pro Deo.

Expulsé de l'île en 1798 par Napoléon Bonaparte, en route pour l'Égypte, l'Ordre de Malte est toujours reconnu comme État souverain par une douzaine de pays auprès desquels il délègue ses ambassadeurs. Cantonné dans son rôle humanitaire, il fait figure de précurseur des ONG modernes (Organisations Non Gouvernementales).